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高效液相色谱法35问35答,鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰等系列问题一步到位!(上篇)

2020-05-11 16:50:24  来源: 检测家

按分离机制的不同,高效液相色谱法可以分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。


这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题,该如何解决这些问题呢?

(点击查看液相色谱产品专区)

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01 用高效液相色谱法进行分析时,保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?



  • 关于漂移问题


1、温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定

2、流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3、柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡

  • 关于快速变化问题

1、流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定

2、泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出

3、流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合




02 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?


1、筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子

2、存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子

3、可能柱超载,减少进样量



03 高效液相色谱法灵敏度不够的主要原因及解决办法


1、样品量不足,解决办法为增加样品量

2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4、检测器衰减太多。调整衰减即可

5、检测器时间常数太大,解决办法为降低时间参数

6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗

7、检测池中有气泡。解决办法为排气

8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可

9、流动相流量不合适。调整流速即可

10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线



04 做高效液相色谱法分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决?


1、泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理

2、比例阀失效,更换比例阀即可

3、泵密封垫损坏,更换密封垫即可

4、溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法

5、系统检漏,找出漏点,密封即可

6、梯度洗脱,这时压力波动是正常的



05 我最近更换了另一种牌号的ODS柱,虽然分离情况仍可以,但保留时间不能重现,为什么?


这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。

尽管过去几年来,填料的制造技术有了极大的提高,但不同的厂商的ods填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。

因此,同一被分析物中的各组分在不同牌号的ods柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物,如三乙基胺(tea),将会使硅醇基的成键能力饱和,从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。

如分离情况可以,系统稳定,达到系统适用性要求,就不必保留时间的重现。



06 我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高,请问为什么?



柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,可按下面步骤检查问题的起因:

1、拆去保护预柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查

2、把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查

3、将柱子的进出口反过来接在仪器上,用10倍柱体积的流动相冲洗柱子。此时,不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动池。这时,如果柱压仍不下降,再检查。只适用于使用过的柱子

4、更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高,请与厂商联系

一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。



07 色谱双峰产生的可能及判断和处理?



HPLC分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度),峰型应对称而尖锐。

但是,在对样品了解程度不够,方法不妥,样品处理方法及进样方式不合理的情况下,会出现各种意想不到的问题,而难以对色谱峰作出合理的解释,对于新手来说更是如此。

色谱双峰指的是一种物质,在色谱图中出现双峰,表明含二种物质。这种情况分为四种原因:



  • 色谱柱

如果你分析样品时发现每个色谱峰都出现双峰(出峰越快,双峰的可能性会减少),尤其采用单一纯物质时,可以肯定色谱柱出了问题——柱头受损或柱头固定相变脏或流失。

如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受堵。将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,一般情况下就行了。

当然不反冲,正冲有时也会正常的。如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,这时可以将进样头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这种活,需要一定技术,同时不能老干那种事,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效很低而报废。


  • 溶剂极性及进样量

许多HPLC分析者对此可能不以为然,一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。

目前,HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。

当用溶剂极性强度大的试剂,如,纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如,定量管为20μL,此条件下完全可以肯定,单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。

这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。

上面提到进样量造成双峰的一个原因,另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。


  • 样品的特性

有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。

在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如,红霉素等。

有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图上较明显。


  • 参数

记录的参数一般都内定的,不必修改,但GC和HPLC的参数是不完全一致的。

例如,c-r3a数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2MS,HPLC为5MS,如果记录间隔时间缩短,一个峰将变为二个峰或更多。



08 色谱柱中的流动相会排干吗?


不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动相吸干了,HPLC系统由此而停止工作了。

如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?

事实上,如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干,并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体,而不能输送空气。

相比之下,另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。

同样,整个色谱柱干涸的情况不太容易发生,多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了,因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了,也不一定就不可救药了。

可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂(如经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面;已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要(以1mL/min的流速)冲一个小时或更多的时间被彻底浸润,恢复到正常状态。



09 使用peek管路和接头需要注意什么问题?


如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱,使用peek材料制成的管路和接头会非常方便。peek管路容易连接;peek接头不仅无需工具,手拧即可固定,而且容易调节锥箍之外的管路长度,方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

使用此类材料的管路需要注意的是:peek对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解peek材料的明显迹象,但,peek遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力,但peek管只能耐受近4000psi(但多数hplc应用系统压力不会超过3000psi)。

使用peek接头时则无需担心接头耐溶剂性能,因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的peek接头压力限低于不锈钢管,因而压力太高时,可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。



10 液相色谱梯度洗脱中柱温的影响?


  • 等度保留


大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置,但这种设置可能引起室温显著变化,这对整夜运行的色谱系统就会有一些影响。


例如,我们实验室的夜间温度就设为4~7℃。在不同的季节,实验室的夜间温度可能比正常工作日的温度高或低,这种温度的变化就会使色谱峰离开“保留时间窗”,造成连续进样中产生一系列的无效数据。

 

还有一个可能的温度影响因素就是色谱仪器在实验室的位置。当色谱柱正对着空调的送风口时,虽然整个实验室的温度非常稳定,但色谱系统的温度就会不断的变化。这就是我们要使用柱温箱的原因之一。


  • 梯度保留

温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。即便如此,若梯度洗脱时不控制温度的话,保留值一般都会有较大的变化。

我们发现柱温在液相色谱梯度洗脱过程中扮演了一个重要的角色,首先,提高柱温可以缩短保留时间,其次,我们看到柱温还可以影响选择性,最后,温度的不平衡会导致峰扭曲变形。这些提醒我们,如果想得到稳定可靠的分离结果,色谱柱的温度变化是不可忽视的。




11 为何会基线漂移


1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器)

2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移)

3、流通池被污染或有气体

4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)

5、流动相配比不当或流速变化

6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

8、样品中有强保留的物质(高k’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线

9、使用循环溶剂,不提倡。未调整检测器

10、检测器没有设定在最大吸收波长处



  • 解决方法

1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器

2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用在线脱气或氦气脱气

3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池,如有需要,可以用1n的硝酸。(不要用盐酸)

4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗

5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速

6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10~20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。使用离子对试剂、缓冲盐更应注意平衡柱

7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、改变分析条件。使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子

9、重新设定基线。使用新的流动相

10、将波长调整至最大吸收波长处。重选检测波长




12 规则的基线噪音是如何产生的



1、在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰)

2、漏液

3、流动相混合不完全

4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)

5、在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声)

6、泵振动 



  • 解决方法

1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。

3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂

4、减少差异或加上热交换器

5、断开lc、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。采用精密级稳压电源。

6、在系统中加入脉冲阻尼器




13 不规则的基线噪音是如何产生的


1、漏液

2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成

3、流动相各溶剂不相溶

4、检测器/记录仪电子元件的问题

5、系统内有气泡

6、检测器内有气泡

7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。

8、检测器灯能量不足

9、色谱柱填料流失或阻塞

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常



  • 解决方法

1、检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液

2、检查流动相的组成

3、选择互溶的流动相

4、断开检测器和记录仪的电源,检查并更正

5、用强极性溶液清洗系统

6、清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器

7、用1n的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

8、更换灯

9、更换色谱柱

10、维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置





在下期内容中,我们将继续对出现保留时间漂移、鬼峰、峰拖尾、倒峰等问题的原因以及实验室常用脱气方法、评价色谱柱的基本指标等内容进行解析。


*内容来源 实验室经理人,侵删


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