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miRcroRNA转染流程

2020-07-30 16:49:35  来源: 中洪博元医学实验帮

细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染(永久转染)两大类。本实验室主要是质粒转染、miRcroRNA转染、慢病毒转染、药物转染、多肽转染等。

  一. 实验材料及试剂

  六孔板、CO2培养箱、EP管、酒精灯等;无血清培养基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC细胞等。

  二、实验内容

  1、当六孔板中MSC细胞密度达90%时,准备转染,将无血清培养基、MEM-α或DMEM取出复温并注意平衡好;

  2、取出细胞,将培养基换成无血清培养基,放回孵箱培养;

  3、取灭菌的EP管,按要求混好RNA(约100pmol/孔),每管250ul DMEM,混匀;

  4、另取EP管,加入lipofectamine 2000(5 ul/孔)和MEM-α或DMEM(250ul/孔),轻轻混匀后室温静置5min;

  5、将上述两个EP管混匀;

  6、室温静置20min,将lipofectamine 2000-质粒混合液滴到六孔板中,500ul/孔;

  7、将细胞放回孵箱培养,4h后换回含血清的完全培养基。

  三、注意事项

  1、转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和链霉素,一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素。

  2、如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5mL无血清培养基。

  3、在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。



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