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MTT原理和注意事项

2020-11-24 13:13:28  来源: 实验之家

MTT原理

  MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di -phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

  MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处(也有用570nm波长的,我目前用的都是570nm)测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

  缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

  MTT溶液的配制方法

   通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。

   需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

  MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。我自己操作一般是每次配制15ml,过滤后4℃避光保存,在两周内用完。

  MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

  配制MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。

  普通MTT法实验步骤:

  1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细

  胞接种到96孔板,每孔体积200ul.

  2:培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

  3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,

  终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

  每孔加150ul DMSO,脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解。

  4:比色:选择490nm(570nm)波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为

  横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

  药物MTT法实验步骤

  贴壁细胞:(我的主要操作是贴壁细胞)

  1:收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000 -

  10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。

  2:5%CO2,37℃孵育,至细胞贴壁,加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。

  3:5%CO2,37℃孵育24-72小时,倒置显微镜下观察。

  4:每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,

  可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

  5:终止培养,小心吸去孔内培养液。

  6:每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免

  疫检测仪OD490nm(570nm)处测量各孔的吸光值。

  7:同时设置调零孔即空白组(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介

  质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

  悬浮细胞:

  1:收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640)。

  2:置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

  3:每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)

  4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。

  5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。

  注意事项:

  (1)选择适当得细胞接种浓度。每孔1000-10000个,但是也要看细胞种类和状态。我做的是药物抑制肿瘤细胞生长和增殖,铺过2000至8000个每孔。2000太低,8000过高,对于阴性组高于5000个吸光值就很大,大于1.5。所以对于我自己的A549实验一般选用3000-5000。一般每孔4000个细胞为宜

  (2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

  (3)设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

  (4)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。(阴性组在0.8-1.2,加药组在0-0.7.)

  (5)用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO。加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

  (6)MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。

  (7)铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致,一般每加几孔就混匀一下。我一般是加完一排复孔就混匀一次。



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