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如何预防PCR 实验防污染

2018-08-20 09:48:09  来源: 检测家

进行分子检测操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。



PCR 实验污染和细胞污染是有差别的,PCR 实验污染主要是核酸而不是细菌和其他入侵者。因此所有的预防措施都会稍稍有所不同。


PCR 实验预防污染关键就在于对每个步骤进行严格分区啦,这个不必多说。


试剂配制区、样品处理区、核酸扩增区和产物分析室的顺序,依次来说说哪些问题需要重点盯防。

试剂配制区

试剂配置区,看上去很简单,操作也很重复。如果在试剂配制阶段,就产生污染的话,预示着实验员将完整地浪费一次实验时间。

所以,在试剂配置区,移液工具和溶液都要定期消毒。

枪头要及时更换

试剂管的盖子要及时盖上


不管有没有可疑的污染源,在试剂配置区,都要定期检查污染情况,这样才能及时发现问题所在。

核酸提取区

实验员最常用的核酸提取,就是用商品化核酸提取试剂盒来手工提取。而且在这个过程中,要涉及到多次加液、转移、离心操作,可谓是雷点重重。


在核酸提取中,试剂通常会存在有机组分,会产生漏液滴液现象


而离心过程中,样品里的细菌、细胞、血液之流,还有可能随着离心机,变成气溶胶,在空气中四处飘荡,威胁着生物民工的生命安全。


当实验室充满了危险物质和污染源的时候,大咖选择另开一个楼层,重建一个实验室。而普通实验员该怎么做呢?



加液和移液时

升级移液技术,就能有效地防止在加液和移液时,发生滴液、漏液,进而污染工作台和其他样本。比如移取含挥发性有机溶液的试剂时,我们可以进行预润洗或者更换适配性好的吸头。


另外,把移液器换成分液器能显著地改善滴液漏液的情况。 



离心时

当小心翼翼地安置好试剂,等待离心结束,期待满满地打开离心机盖子的时候,却发现一个破碎的离心管,整个画面真是令人心碎。


离心管破碎,免不了又开始洗洗洗


因此离心的时候,还是要选择质量可靠的离心管。

 

而藏污纳垢重灾区之一——离心机的转子和吊篮,也要选择便于高温杀菌消毒的那种,这样,就可以节约很多消毒清洁的时间啦。


实验全程控制

在实验的过程中,增加空白提取对照或阴性样本提取对照,对核酸提取过程和实验环境进行控制。

核酸扩增区和产物分析区


这两个区域涉及 PCR 实验的准备、运行以及 PCR 产物的分析。PCR 实验因为十分敏感而备受欢迎,不过这个敏感的优势,也同样放大了污染。极其微量的污染,就可能反手摔一个假阳性结果给你。


而且 PCR 实验中,运行中的电泳池附近,会有大量 DNA 扩散,一旦出现气溶胶污染,就真是又要关闭实验室了。


在这个区域当中,主要的污染集中在 3 个地方: 


模板间交叉污染:

主要是在取样加样的过程中,由于移液器之间的交叉形成的污染。


移液器所造成的污染,如果是表面的话可以经常使用 70% 的酒精进行擦拭,而内部造成的污染,因为消毒清洁比较困难,所以最好选用集吸液放液脱卸吸头于一键的移液器。


吸头中的滤芯,也能够阻止气溶胶扩散,防止污染的产生。


PCR 试剂的污染:

主要是在 PCR 组分试剂加样过程中,由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。   


加样过程中,因为 PCR 试剂对温度十分敏感,需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR 板/管处于 0℃,但这个过程也是充满了污染的风险的。


而改用 PCR-Cooler 低温指示冰盒和 IsoTherm-System 冰盒系统,就可以不用再通过冰浴避免污染风险,保证样品和试剂的安全了。


PCR 扩增产物污染:

这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的 PCR 产物污染,就可形成假阳性。


每一项准备工作没有做好,都会影响到扩增产物区,因此,想要顺利地出结果,文中提到的注意点,都要小心谨慎地对待。


另外,降低 PCR 实验的频率也能降低被污染的风险。能一次做 50 个,不要分开 5 次每次做 10 个。不用频繁做 PCR 实验,实验数据也更好看。


总结了两条十分有用的小诀窍:


 面对多份样品,制备反应混合液时,先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后用分液功能进行分装。

 在加入模板时,按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序,操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则。



(内容来源:Eppendorf实验室 由小析姐整理编辑)


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